NRPB57S Ni-NTA琼脂糖凝胶FF预装柱

相关介绍： 

Ni-NTA琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，通过活化偶联次氮基三乙酸（NTA），再螯合Ni²⁺。与亚氨基二乙酸（IDA）相比，具有更好的螯合剂、还原剂、碱性的耐受性，如样品中含有1-10mM EDTA或1-10mM β-巯基乙醇或5mM DTT，可正常纯化；在螯合镍的情况下，也可以用0.1M NaOH清洗。

Ni-NTA琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni²⁺形成稳定的配位键，因此能特异、牢固、可逆地吸附于固定这些金属离子的基质，结合了His-Tag重组蛋白的Ni-NTA琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。

技术指标：

使用方法：

1、色谱柱装填

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的蒸馏水。

（3）将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。

（4）柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则正常流速下填装。

（5）填装好的Ni-NTA琼脂糖凝胶FF柱用2-5个柱体积的初始缓冲溶液平衡，建议流速100cm/h，平衡后的柱子可以用于His-Tag重组蛋白的上样和洗脱纯化。

2、上样

（1）缓冲液选择：一般选用pH6-8的结合缓冲液，常用缓冲液有10-00mM 磷酸钠缓冲液、20-200mM Tris-HCl缓冲液等。在缓冲液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。在初次使用Ni-NTA琼脂糖凝胶FF，推荐使用50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作为结合缓冲液。

（2）样品处理：样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。为保证缓冲液一致，可以在结合缓冲液中破碎细菌、或调解pH与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液（常用方法有透析、超滤、脱盐柱换液等）、或用结合缓冲液稀释2-10倍等。样品上柱前应0.45μm过滤。

3、洗脱

（1）Ni-NTA琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。

（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl进行调节pH。

（3）在初次使用Ni-NTA琼脂糖凝胶FF，不知道洗脱的咪唑浓度，建议在结合缓冲液中分别加入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑，浓度从低到高，分别洗脱和收集，通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱组份。

（4）有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱，确定较佳洗脱条件。

4、在位清洗

在多次使用后需要在位清洗，常用方法为先5个柱体积蒸馏水清洗，再用1-3个柱体积50mM NaOH清洗10-20min，立即用5个柱体积结合缓冲液（50mM PBS）清洗平衡。

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