NRPB07L Ni-IDA琼脂糖凝胶FF

发布日期:2018-10-27 阅读次数:90

品  名:Ni-IDA琼脂糖凝胶FF

英文名:Nickel Iminodiacetic acid NUPharose Fast Flow,Ni-IDA NUPharose FF

目录号:NRPB07L、NRPB07S(预装柱)

规  格:20 ml,100 ml,1 L,1 ml预装柱,特殊规格订制

运  输:2 ~ 30℃,常压、避光

贮  存:20%乙醇,2 ~ 25℃

保质期:5年


相关介绍: 

镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质,通过活化偶联亚氨基二乙酸(IDA),再螯合Ni2+。其中IDA是金属螯合层析中最常用的配体,与次氮基三乙酸(NTA)相比,具有亲和力强,载量高,可再生重复使用的特点。

镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签(His-Tag)的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni2+形成稳定的配位键,因此能特异、牢固、可逆地吸附于固定这些金属离子的基质,结合了His-Tag重组蛋白的镍-琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。


技术指标:

基质

4%琼脂糖凝胶

配基

-N(CH2COOH)2

配基密度

≥25 μmol/ml

填料粒径

60 ~ 180 μm

最大流速

800 cm/h

推荐流速

50 ~ 100 cm/h

pH稳定性

pH 5 ~ 12pH 3 ~ 14(脱镍)

耐反压

0.3 MPa

载量

≥40 mg His-tag重组蛋白/ml 


使用方法:

1.色谱柱装填

1.1 所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一至,液体最好做脱气处理。

1.2 在柱子下端加入蒸馏水,以除去柱子中的空气,关闭柱子出口,在柱内保留少量的蒸馏水。

1.3 将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时,要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流,以减少气泡的产生,让填料先自然沉降。

1.4 柱压不超过0.3 MPa,如果装柱系统中无法测柱压,则控制流速高于300 cm/h,但是在使用中一般只用最大流速的75%。

1.5填装好的镍-琼脂糖凝胶FF柱用2 ~ 5个柱体积的初始缓冲溶液平衡,建议流速100 cm/h,平衡后的柱子可以用于His-Tag重组蛋白的上样和洗脱纯化。

2.上样

2.1 样品一般溶解在pH6 ~ 8的初始缓冲液中,提高上样缓冲液的pH值,可以增大载量。

2.2 缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐,也最好不含巯基乙醇、DTT等还原剂。

2.3常用缓冲液有10 ~ 100 mM 磷酸钠缓冲液、20 ~ 200 mM Tris-HCl缓冲液等。

2.4在缓冲液中一般要加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl,以消除离子交换作用。

2.5在初次使用镍-琼脂糖凝胶FF,推荐使用50 mM PBS(50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,NaOH调节pH 7.4)作为初始缓冲液。

3. 洗脱

3.1 镍-琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。

3.2咪唑为碱性,相应缓冲液配制后需要用HCl进行调节pH。

3.3在初次使用镍-琼脂糖凝胶FF,不知道洗脱的咪唑浓度,推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑,浓度从低到高,分别洗脱和收集,通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定。

3.4 有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱,确定较佳洗脱条件。


拓展应用:

1. 更换不同的螯合离子

1.1 IDA螯合的镍-琼脂糖凝胶FF可以用EDTA脱掉镍,脱掉镍后可以用0.1 ~ 1.0M NaOH进行清洗凝胶,再重新螯合镍,使凝胶焕然一新。也可以螯合其他金属离子,如Cu2+,Zn2+,Co2+,Fe3+等,进行多样纯化。

1.2 脱镍方法:用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子,再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子,再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

1.3螯合金属离子方法:用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子,用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属,螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗,去除未螯合的金属离子。

1.4 金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐,如为NiSO4、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、PbSO4等,金属盐溶液应中性或弱酸性,且必须经过过滤,以防止金属盐在胶上沉淀。

1.5 如果是Fe3+必须在低pH下螯合(pH 3),以防止Fe3+产生沉淀,一般可以加入少量盐酸和硫酸保持pH。

2. 多种洗脱方法

2.1 降低pH洗脱:大多数蛋白在pH 4 ~ 6会被洗脱下来,也可以在pH 3 ~ 4,缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸或磷酸盐缓冲体系。

2.2 竞争性洗脱:线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质,如0 ~ 0.5 M咪唑,0 ~ 50 mM组氨酸,0 ~ 2 M NH4Cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。

2.3 螯合剂洗脱:EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力,导致蛋白被洗脱下来。这种方法不能使不同的蛋白分离,此外会影响蛋白吸附,导致融合蛋白不能挂柱。

2.4 所有上述情况中,缓冲液中必须加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以消除离子交换作用。

2.5 当螯合离子配基是Cu2+时,有以下的三种操作方式。

降低pH洗脱:

上样缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4

洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 3.5

竞争性洗脱:

上样缓冲液:50 mM NaH2PO4,1 M NaCl,pH 7.4

洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,1 M NH4Cl,pH 7.4

螯合剂洗脱:

上样缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4

洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,50 mM EDTA,pH 7.4

注:配制的缓冲液需要用NaOH或HCl调节至要求的pH。使用降低pH和螯合剂洗脱会使金属离子脱落,下次使用得重新螯和金属离子,最常用的为竞争性洗脱。


再生、清洗:

1. 凝胶的再生

1.1 多次使用后或需要更换螯合的金属离子,必须将胶脱镍再生。脱镍方法:用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子,再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子,再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

1.2 多次使用的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法:用0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清洗柱子,流速50 cm/h,保持1 ~ 2 h,能去除结合强的杂质,同时也能去除热源。

1.3 清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法:用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子,用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属,螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗,去除未螯合的金属离子。

2.在位清洗

2.1 除去因离子交换作用吸附的蛋白,用2 ~ 3个柱体积2 M 的NaCl溶液反向清洗柱子。

2.2 除去强的疏水性蛋白和脂质等,用4个柱体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇反向清洗柱子。

2.3 除去蛋白沉淀、疏水性蛋白,参照凝胶的再生。


注意事项:

推荐流速

预装柱体积

1 ml

5 ml

10 ml

流速(ml /min )

0.2

1

2