纳米抗体发展史

一、纳米抗体的发现

  比利时科学家Hamers-Casterman及其团队于1993年在《自然》杂志上，首次公开发表了关于纳米抗体的研究结果：在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，这些“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，而且不像单链抗体那样互相聚集。随后Andrew等科学家从鲨鱼血液中也发现了这种小型抗体。

针对这种天然缺失轻链的重链抗体，克隆其重链可变区（Variable Region of the Heavy Chain，VH）可以得到只有重链可变区组成的单域抗体（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），具有与原重链抗体相当的结构稳定性，且与抗原的结合活性不变，是已知的可结合目标抗原的最小单位，分子量约为12~15 kDa，也被称作纳米抗体(Nanobody, Nb)。

相比于传统抗体，纳米抗体的活性结合区域较长，其温度稳定性及有机溶剂耐受性更强，部分还可耐受蛋白酶，在更广的酸碱范围内保持活性。此外，纳米抗体的制备可选择使用工程菌表达，相较于传统抗体的杂交瘤细胞制备方式，具有易表达、易于基因工程改造等优点。

二、纳米抗体的独特优势

1、分子质量小、更强的组织穿透力：纳米抗体的分子质量小，这使得它们能够更容易地穿透生物屏障，如细胞膜和组织，从而更有效地到达目标位置。

2、易人源化免疫原性低：编码骆驼来源的纳米抗体的基因与人类3型VH结构域(VH3)具有高度的同源性，在人体内的免疫原性较弱。

3、高稳定性：纳米抗体在极端条件下，如高温、低温、有机溶剂和酸碱环境中，都能保持其结构和功能。这种高稳定性使得纳米抗体在储存和运输过程中更加方便，同时也为它们在恶劣环境下的应用提供了可能。

4、高亲和力：VHH与常规的VH相比，有更长的互补决定区3(CDR3)，这种长CDR3结构易形成凸环结构，可以结合一些难以结合的抗原表位，因此弥补了纳米抗体由于轻链缺失而导致的抗原结合能力下降的缺陷。

5、适于工业化生产：纳米抗体易在细菌、酵母等表达系统中进行重组表达，此外，其生产过程相对简单，成本较低，有利于规模化生产。

三、纳米抗体的分类

利用纳米抗体所具有的特性，对其进行基因改造，可转变为多种形式，携带某些特定的结构，用于疾病的诊断和治疗。

1、单价纳米抗体

用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。

2、多价和多特异性纳米抗体

多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比单价抗体具有更高的抗原亲和力；多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起,从而转换成多价和多特异性的形式。

3、融合型纳米抗体

纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。进行疾病治疗时，可以通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。

四、纳米抗体的应用

纳米抗体作为一种新兴的生物纳米技术，凭借其结构和功能的特异性，加之极高的稳定性和亲和力，在很多方面具有广泛的应用。包括生物医学研究、临床诊断和治疗、药物递送以及生物传感等。

纳米抗体可以用于识别和定量细胞表面以及组织中的特定抗原。在免疫组化和免疫荧光染色中，用于标记和追踪细胞内和细胞间的特定蛋白。纳米抗体可以作为分子成像试剂，用于肿瘤和其他疾病的早期诊断。在免疫层析检测中，纳米抗体可以用作捕获或检测抗体，用于快速检测病原体或生物标志物。纳米抗体作为分子成像试剂也具有独特的优势，用于肿瘤和其他疾病的早期诊断，在临床前和临床模型中都显示出巨大的潜力，正逐渐成为新一代肿瘤临床诊断技术的重要工具。

此外，将治疗性化合物与诊断性放射性示踪剂结合，并进行诊断扫描，该化合物在肿瘤细胞中的积累可以实现可视化。放射性标记的纳米抗体可以用于识别特定的肿瘤相关生物标志物，从而帮助癌症诊断和确定适当的治疗方法。纳米抗体可以迅速扩散到组织中，并特异性地在靶组织中积累，快速产生高对比度图像，从而对患者进行早期诊断。

纳米抗体作为药物载体，也具有一些传统递送系统所不具备的优势。通过调控其结构和功能，靶向输送药物到病变部位，减少对正常组织的损害，实现更高效的药物递送。与传统药物递送系统相比，纳米药物递送系统因其尺寸、形状、材料等的特殊性，可有效改善药物的药代动力学和药效学性能，进而提高疗效。

五、纳米抗体制备流程

1、设计抗原免疫驼源动物

以大分子或小分子结构为基础设计半抗原，并偶联蛋白制成抗原去免疫驼源动物，一般免疫过程要进行多次，以确保动物体内产生足够的针对特定抗原的淋巴细胞。

2、提取RNA并建立噬菌体文库

先获取免疫后动物的外周血液，提取血液中淋巴细胞中的RNA，通过反转录生成cDNA，利用PCR扩增特定的抗体基因区域（通常是VHH），将扩增的基因片段克隆到噬菌体表达载体中，建立噬菌体文库，经噬菌体展示技术得到多株阳性克隆细胞株。

3、筛选阳性克隆

利用噬菌体展示技术，将抗体文库中的噬菌体表达在细菌表面。进一步通过合适的筛选手段，筛选出能够特异性结合抗原的噬菌体克隆，将用于进一步的表达和纯化。

4、纳米抗体的表达纯化

将阳性克隆的基因转入大肠杆菌或其他表达系统进行表达，达到适当的表达水平后，收集和裂解含有表达纳米抗体的细菌细胞，随后制定合适的纯化策略，完成对纳米抗体的纯化，获得符合要求的产品。

随着纳米抗体研究的不断深入，其应用场景也越来越广阔。将纳米抗体与其他的科研、诊断、治疗手段相结合，将会产生无限的可能性，这也是科学家们积极探索的研究热点。