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NRPB53S:重组耐碱蛋白A检测试剂盒 
 日期:2015/7/13  阅读次数: 1952  来源:纽龙生物  
 
 

重组耐碱蛋白A检测试剂盒

品    名:重组耐碱蛋白A检测试剂盒(Recombinant Alkali-tolerant Protein A test kit)

目 录 号:NRPB53S

规    格:96

保 质 期:1

一、试剂盒组成

名称

体积

描述

储存

110×样品稀释剂

30ml

使用前用蒸馏水稀释10倍,用于样品稀释和洗板。

避光

2-8

2TMB显色液A

6ml

使用前A液和B1:1混合,避光,2-8保存。用于显色反应。

3TMB显色液B

6ml

4、终止液

6ml

用于终止显色反应。

5、人免疫球蛋白(IgG

300μl

50mg/ml,用于标准曲线制作。

6、酶标板

1

已包被抗体。

7、重组耐碱蛋白Arat-PA

20μl

1mg/ml,用于标准曲线制作。

-20

8HRP标记抗体

30μl

20μl用稀释剂稀释至10ml

 

二、简介

重组耐碱蛋白A(简称rat-PA)是在天然金黄色葡萄球菌蛋白A的基础上对蛋白质结构进行改造,去除同Fab片段的结合位点,增强其同Fc片段结合的转移性,同时提高了蛋白质的稳定性和耐碱性。广泛用于单克隆和多克隆抗体的纯化。

随着人们对免疫球蛋白质量越来越高,在使用rat-PA柱纯化免疫球蛋白时,从柱上脱落的rat-PA可能成为污染物。所以对洗脱样品进行脱落的rat-PA检测是有必要的。

Elisa检测过程中,样品中脱落的rat-PA会与抗体形成rat-PA-IgG复合物,这种复合物使定量检测变得非常复杂,因此解除这种复合物的影响是准确定rat-PA的关键。

本方法使用沸水浴处理样品,解除这种复合的影响,经过多项试验测试,rat-PA煮沸后不会沉淀,IgG会产生大量沉淀失活,IgG沉淀会吸附少量rat-PA,所以样品煮沸后需要将沉淀打散均匀再离心,同时用已知浓度含IgGrat-PA制作标准曲线,与样品相同处理,可以排除沉淀微量吸附引起的误差。

本方法是已将一个rat-PA检测特制抗体包被在酶标板,在rat-PA结合后,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体结合rat-PA,再用TMB显色底物显色。TMBHRP的催化下共产物显蓝色,并在酸的终止作用下,产物由蓝色转化为黄色在一定的rat-PA浓度范围内,其颜色深浅与样品中rat-PA含量呈正比。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。根据rat-PA浓度标准曲线计算出样品中含有rat-PA的量。

三、实验步骤

所有试剂使用前应先在室温(18-30)平衡30min以上,恢复至室温。

3.1 样品稀释

样品需在pH6-9的缓冲液中,或者用样品稀释剂适当稀释后pH应在此范围内。稀释后的抗体浓度应该小于1mg/ml

3.2 标准品稀释

标准品:20μl 1mg/ml rat-PA标准品,用80μl 1×样品稀释剂稀释10倍,为200μg/ml;然后取50μl 200μg/ml rat-PA,加450μl 1×样品稀释剂稀释10倍,为10μg/ml;按此法逐步稀释为500μl 20ng/ml;然后再2倍倍比稀释至1052.51.250.6250.3130ng/ml,每样500μl

IgG250μl 50mg/ml IgG溶液,加2.25ml 1×样品稀释剂稀释10倍,为5mg/ml;然后取2ml 5mg/ml IgG,加3ml 1×样品稀释剂稀释至2mg/ml

混合:分别取201052.51.250.6250.31250ng/ml rat-PA标准品250μl,与250μl 2mg/ml IgG混合。即为含1mg/mlIgG1052.51.250.6250.3130.1560ng/ml rat-PA标准品500μl

3.3 沸水浴预处理

将稀释好的样品和标准品在沸水浴中煮沸5 min,然后冷却,将沉淀打散,再12000rpm离心3min去除沉淀。根据需要,使用样品稀释剂稀释煮沸过的样品,作不同稀释度检测,稀释后的rat-PA应在试剂盒的检测范围(0.15-10ng/ml,柱洗脱样品rat-PA残留一般为1-10ng/mg抗体)。

3.4 加样

样品(控制抗体浓度在0.1-1mg/ml和标准品每孔加100μl,根据需要设置重复孔数,一般2个重复以上。加样时注意将样品加于酶标板孔底部,不要有气泡,加样尽量不触及孔壁。酶标板加上覆膜(或盖子,本试剂盒未提供),37湿盒温育1h,用样品稀释剂洗板3次,拍干。

3.5 HRP标记抗体

HRP标记抗体用样品稀释剂稀释500倍,每孔加100μl,需新鲜配置。酶标板加上覆膜,37湿盒温育1h,用洗涤液洗涤6次,拍干。

3.6 显色

A液和B1:1混合,现配现用,各孔加混合好TMB底物液100μl,室温避光反应10min

3.7 终止

每孔加50μl终止液终止反应。

3.8 读数

用酶标仪在450nm波长处测定OD值。

四、结果结算

4.1 计算重复样的平均OD值。

4.2 OD值为纵坐标,rat-PA浓度为横坐标,绘制标准曲线,获得线性公式。

以下数据仅做参考。每一次实验都应做一个标准曲线用于计算样品的值。

rat-PA(ng/ml)

0

0.156

0.313

0.625

1.25

2.5

5

10

OD450nm

0.089

0.105

0.125

0.143

0.192

0.299

0.451

0.751

 

4.3 未知样品rat-PA浓度可由标准曲线查得,或根据计算公式计算(ng/ml)。

4.4 根据样品稀释度和抗体浓度计算每mg抗体中rat-PA的含量(ng/mg)。

五、特异性

对rat-PA具有较高的特异性,对BSA、GH等蛋白无交叉反应,除此之外,对0-10ng/ml的SPA和SPG(含1mg/ml人免疫球蛋白)本试剂盒不显色,对于5μg/ml以上的SPA和SPG完全显色,且处于饱和状态。

六、精密度

精密度用百分之变异系数(CV)来表示。根据实验样品在低,中,高三个不同浓度范围内重复测定的数值来计算标准偏差和平均值,变异系数则是由上述标准偏差除以平均值计算得来。虽然实验室和操作人员不同,实际的精度可能会有所不同,但建议操作人员在报告结果之前先通过测试确定精度。

批间差

实验次数

平均值(ng/ml

, , , CV%

12

0.637

10.5

12

1.343

11.7

12

2.646

10.9

12

5.194

5.2

12

9.820

1.7

 

批内差

实验次数

平均值(ng/ml

CV%

10

0.608

5.4

10

2.592

3.5

10

10.013

2.4

 

七、灵敏度

将耐碱蛋白A零标准加2个标准差的信号(OD)对应的平均浓度定义为检测限(LOD),是由标准曲线6次以上的平均结果确定的。零标准加2 SD的平均信号产生一个LOD约~ 156pg/ml。

 

 
 
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