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NRPB15S:重组链球菌蛋白G检测试剂盒 
 日期:2016/5/19  阅读次数: 1483  来源:纽龙生物  
 
 

重组链球菌蛋白G检测试剂盒

一、试剂盒组成

名称 体积 描述 储存
10×样品稀释剂 30 ml 使用前用蒸馏水稀释10倍,用于样品稀释和洗板 避光2 ~ 8℃
TMB显色液A液 6 ml 使用前A液和B液1:1混合,现配现用,避光,2 ~ 8℃保存。用于显色反应 避光2 ~ 8℃
TMB显色液B液 6 ml 使用前A液和B液1:1混合,现配现用,避光,2 ~ 8℃保存。用于显色反应 避光2 ~ 8℃
终止液 6 ml 用于终止显色反应 避光2 ~ 8℃
人免疫球蛋白(IgG) 300 μl 50 mg/ml,非SPG柱纯化获得,用于标准曲线制作 避光2 ~ 8℃
重组蛋白G(SPG) 20 μl 1 mg/ml,用于标准曲线制作 避光2 ~ 8℃
酶标板 1 块 已包被抗体 避光2 ~ 8℃
HRP标记抗体 30 μl 二抗,25 μl用稀释剂稀释至10 ml -20℃

二、简介
        链球菌G蛋白(简称SPG)是G、C型链球菌细胞壁中的一种蛋白质,能特异性的同免疫球蛋白IgG分子的Fc段结合。广泛用于单克隆和多克隆抗体的纯化。
随着人们对免疫球蛋白质量越来越高,在使用SPG柱纯化免疫球蛋白时,从柱上脱落的SPG可能成为污染物。所以对洗脱样品进行脱落的SPG检测是有必要的。
        在Elisa检测过程中,样品中脱落的SPG会与抗体形成SPG-IgG复合物,这种复合物使定量检测变得非常复杂,因此解除这种复合物的影响是准确测定SPG的关键。
        本方法使用沸水浴处理样品,解除这种复合的影响,经过多项试验测试,煮沸后SPG不会沉淀,而IgG会产生大量沉淀失活,IgG沉淀会吸附少量SPG,所以样品煮沸后需要将沉淀打散均匀再离心,以释放少量被吸附的SPG,同时用含已知浓度IgG的SPG制作标准曲线,与样品相同处理,可以排除沉淀微量吸附SPG引起的误差。
        本方法是利用“三层夹心”原理,已将一个SPG检测特制抗体包被在酶标板,在SPG结合后,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体结合SPG,再用TMB显色底物显色。TMB在HRP的催化下发生转化为蓝色,并在酸的终止作用下最终转化为黄色,在一定的SPG浓度范围内,其颜色深浅与样品中SPG含量呈正比。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)。根据SPG浓度标准曲线计算出样品中含有SPG的量。

三、实验步骤
所有试剂使用前应先在室温(18 ~ 30℃)平衡30 min以上,恢复至室温。
3.1 样品稀释
样品需在pH 6 ~ 9的缓冲液中,或者用1×样品稀释剂适当稀释后pH应在此范围内。稀释后的抗体浓度应该小于5 mg/ml。
3.2 标准品稀释
标准品:取10 μl 1 mg/ml SPG标准品,用90 μl 1×样品稀释剂稀释10倍,为100 μg/ml;然后取50 μl 100 μl/ml SPG,加450 μl 1×样品稀释剂稀释10倍,为10 μg/ml;按此法逐步稀释为500 μl 100 ng/ml;然后再稀释至20、15、10、5、2、1、0.5 ng/ml,每样500 μl。
人IgG:取250 μl 50 μg/ml IgG溶液,加2.25 ml 1×样品稀释剂稀释10倍,为5 mg/ml;然后取2 ml 5 mg/ml IgG,加3 ml 1×样品稀释剂稀释至2 mg/ml。
混合:分别取20、15、10、5、2、1、0.5、0 ng/ml SPG标准品250 μl,与250 μl 2 mg/ml 人IgG混合。即为含1 mg/ml人IgG的10、7.5、5、2.5、1、0.5、0.25、0 ng/ml SPG标准品500 μl。
3.3 沸水浴预处理
将稀释好的样品和标准品在沸水浴中煮沸1 h(水应为沸腾状态),然后冷却,将沉淀打散,再12000 rpm离心2 min去除沉淀。根据需要,使用1×样品稀释剂稀释煮沸过的样品,做不同稀释度检测,稀释后的SPG应在试剂盒的检测范围(0.1 ~ 10 ng/ml,柱洗脱样品SPG残留一般为1 ~ 20 ng/mg)。
3.4 加样
样品和标准品每孔加100 μl,根据需要设置重复孔数,一般2个重复以上。加样时注意将样品加于酶标板孔底部,不要有气泡,加样尽量不触及孔壁。酶标板加上覆膜(或盖子,本试剂盒未提供),37℃湿盒温育1 h,用1×样品稀释剂洗板3次,拍干。
3.5 加HRP标记抗体
将HRP标记抗体用1×样品稀释剂稀释400倍,每孔加100 μl,需新鲜配置。酶标板加上覆膜,37℃湿盒温育1 h ,用洗涤液洗涤6次,拍干。
3.6 显色
将A液和B液1:1混合,现配现用,各孔加混合好TMB底物液100 μl,室温避光反应10 min。
3.7 终止
每孔加50 μl终止液终止反应。
3.8 读数
用酶标仪在450 nm波长处测定OD值。

四、结果结算
4.1 计算重复样的平均OD值。
4.2 以OD值为纵坐标,SPG浓度为横坐标,绘制标准曲线,获得线性公式。

以下数据仅做参考。每一次实验都应做一个标准曲线用于计算样品的值。
SPG(ng/ml) 0 0.25 0.5 1 2.5 5 7.5 10
OD450nm 0.064 0.079 0.0855 0.1165 0.2535 0.412 0.55 0.666


4.3 未知样品SPG浓度可由标准曲线查得,或根据计算公式计算(ng/ml)。
4.4 根据样品稀释度和抗体浓度计算每mg抗体中SPG的含量(ng/mg)。

 
 
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