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NRPB14S:肠激酶酶切去除试剂盒 
 日期:2016/5/19  阅读次数: 1226  来源:纽龙生物  
 
 

肠激酶酶切去除试剂盒

一、试剂盒组成

名称 体积 描述 储存
重组牛肠激酶(rb-EK) 1 ml 含1000 U rb-EK,用于酶切重组融合蛋白。 -20℃
阳性底物 1 mg 冻干粉,酶切的阳性底物,用作对照。 -20℃
20×酶切缓冲液 20 ml 用于酶切的反应体系,稀释至1×为50 mM Tris-HCl,pH 8.0 2 ~ 8℃
STI-琼脂糖凝胶FF 1 ml 用于去除rb-EK的柱子 2 ~ 8℃
10×洗脱缓冲液 10 ml 用于洗脱结合在柱子上的rb-EK,稀释至1×为50 mM Glycine-HCl, pH 3.0。 2 ~ 8℃

二、简介
        肠激酶(EC 3.4.21.9)是一种丝氨酸蛋白水解酶,能高效专一地识别蛋白质中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)序列,并在赖氨酸(Lys,K)的C端水解肽键,产生切割,在生物体内水解胰蛋白酶原转变为胰蛋白酶,由于肠激酶具有高度专一性和高效酶切特性,广泛应用于基因工程产品的开发。本试剂盒中的重组牛肠激酶(rb-EK, NRPA13)采用大肠杆菌分泌表达牛肠激酶的轻链活性核心区域(235A.A., 26.2kDa),比活性更高,特别适用于基因工程融合蛋白的酶切。
        STI-琼脂糖凝胶FF是一种将大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)键合在琼脂糖凝胶微球上形成的生物亲和层析分离介质。主要用于胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血X因子等丝氨酸蛋白酶的提取和纯化,本试剂盒中的STI-琼脂糖凝胶FF(NRPB10)用于rb-EK的去除和回收,实现rb-EK的重复使用。

三、实验步骤
3.1 样品酶切
用1×酶切缓冲液将样品溶解或稀释至1 ~ 5 mg/ml,如样品中含有影响rb-EK活性的物质需要透析至1×酶切缓冲液。根据1 U切50 μg重组蛋白的比例,加入相应量的rb-EK,混匀后,在25℃静置酶切16 h。
3.2 阳性底物对照酶切
   用1 ml 1×酶切缓冲液将阳性底物溶解,取100 μl加入2 U(2 μl)rb-EK,混匀后,与样品相同条件下酶切。
3.3 检测
酶切前和酶切后的样品和阳性底物用SDS-PAGE检测酶切情况。
3.4 rb-EK酶的去除
1 ml STI-琼脂糖凝胶FF柱用1×酶切缓冲液平衡10 ml,将酶切后的样品上柱,流速以0.2 ml/min为宜,收集的穿透液即为去除rb-EK的样品。
3.5 rb-EK的回收
上述样品上完柱后,用1×酶切缓冲液再平衡2 ~ 5ml,然后用1×洗脱缓冲液洗脱与柱结合的rb-EK,收集的洗脱液加入适量的20×酶切缓冲液调节至中性。调节pH后的洗脱液测定rb-EK酶活性后可以重复使用。
3.6 STI-琼脂糖凝胶FF柱保存

中文名称 英文名称 应用 目录号
重组牛肠激酶 Recombinant Bovine Enterokinase 标签蛋白的切割 NRPA13S
STI-琼脂糖凝胶FF STI NUPharose FF 丝氨酸蛋白酶系的纯化 NRPB10S
镍-琼脂糖凝胶FF Ni NUPharose FF His-Tag蛋白的纯化 NRPB07S
GST-琼脂糖凝胶FF Glutathione NUPharose FF GST-tag蛋白的纯化 NRPB08S

 
 
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